為大家講一講雜交捕獲的流程

　　雜交捕獲的原理是人工設(shè)計探針（DNA探針或者RNA探針），探針可以和目標(biāo)區(qū)段部分或者全部互補(bǔ)。將樣本和探針混合，探針會將目標(biāo)區(qū)段捕獲，未設(shè)計探針的區(qū)段會被洗脫丟棄，之后通過變性（一般是調(diào)節(jié)PH值到堿性）將探針和捕獲區(qū)段分開，被捕獲的片段即可進(jìn)行二代測序文庫構(gòu)建。

　　雜交捕獲流程介紹：

　　1、文庫制備

　　將提取后的基因組DNA利用超聲或酶切的方法將基因組DNA進(jìn)行片段化，并進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接，接著進(jìn)行PCR及純化。

　　2、雜交反應(yīng)

　　將帶有生物素標(biāo)記的RNA/DNA探針，對DNA文庫的目標(biāo)區(qū)域片段進(jìn)行結(jié)合（探針應(yīng)過量）。

　　3、鏈霉親和素磁珠結(jié)合

　　使用鏈霉親和素磁珠結(jié)合帶有生物素標(biāo)記的RNA/DNA探針與DNA文庫相結(jié)合的雙鏈復(fù)合物。

　　4、清洗

　　利用不同鹽濃度的緩沖液進(jìn)行多次清洗，主要目的為去除未被探針捕獲的非特異性雜交，保留目標(biāo)區(qū)域的DNA從而達(dá)到捕獲效率的提升。

　　5、捕獲后擴(kuò)增

　　對捕獲及清洗后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建完成靶向富集的測序文庫。

　　雜交捕獲的優(yōu)缺點都是什么呢？

　　優(yōu)點：捕獲區(qū)段大，可以達(dá)到幾百M(fèi)B，遠(yuǎn)超PCR方案和MIP方案，同時根據(jù)探針的原理其均一性很好，均一性是評價捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數(shù)，均一性好后續(xù)測序成本就會下降。

　　缺點：容易捕獲非目標(biāo)片段，造成成本增加。因為雜交前樣本會被隨機(jī)打斷一般認(rèn)為500bp是比較合適的長度，探針捕獲時可能和目標(biāo)片段部分雜交，導(dǎo)致一些含有部分目標(biāo)區(qū)段的片段被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差，容易捕獲非目標(biāo)區(qū)段。